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          • 溶栓活性体外检测办法概况
            宣布光阴>2019-08-08     来源:网上棋牌app 点击:417

              溶栓活性体外检测办法概况

              作者: 赵明,潘映红,王一丁, 中国药事 摘要撰写人 TsingHua

              心血管体系疾病是人类最为常见的一类疾病,已成为当今世界生齿的第一大死因,而由心血管疾病引 发的血栓并发症,是形成死亡或病残的重要原因之一。对付栓塞类疾病,溶栓药物治疗已成为首选 的常规治疗办法。以后临床所用的溶栓药物大多为第1、第2代产品,如尿激酶、链激酶和重组组 织型纤溶酶原激活剂等,它咱们存在易出血、初始再灌注迟延和失败、再梗塞、半衰期较短、本钱高 、无法口服等缺点。第3代溶栓药物研究重要会合在3个方面:一是极力寻找更优越的自然溶栓活 性物质;二是对原有自然溶栓物质的改革;三是原有溶栓药物与另外一成分构成的各种嵌合体<1> 。寻找来源丰富、抉择性更强和可以或许口服的溶栓活性物质已经成为国内外医学和生物迷信的研究热 点之一。迄今为止,已从蛇毒、蚯蚓,某些昆虫如螳螂、搔扰角蝇、舌蝇,某些微生物如芽孢杆菌 、链霉菌、根霉、米曲霉,某些海洋生物如海藻、正鲣等中发现有溶栓活性的酶<2~12>。溶栓活性体外检测是发现和评估溶栓药物的关键技能,重要有纤维蛋白平板法(fibrinplateassay,FPA)、发色底物法(chromogenicsubstrate method)、酶联纤维蛋白溶解法(enzyme linked-fibrinolytic assay,ELFA)、凝块溶解光阴法(clot lysis time assay)、BAEE底物法和酶联免疫吸附法(ELISA)等。溶栓活性体外检测办法大批用于迷信研究、溶栓药物品德节制、临床检验及模范检测中。本文对各种溶栓活性体外检测办法停止了综述比较,为改良溶栓活性体外检测办法和疾速、灵敏挑选新溶栓药物供给参考。1办法概述1 ·1纤维蛋白平板法1·1·1一样平常纤维蛋白平板法纤维蛋白平板法由Astrup<13>、树立,是将纤维蛋白原、凝血酶和琼脂制成半透明状的平板,打孔加样,37℃孵育,激酶激活纤溶 酶原构成纤溶酶,纤溶酶降解纤维蛋白在平板上构成透明圈,透明圈的大小与酶活气有一定相干。 以模范品酶活气的对数与其所构成透明圈的两垂直直径乘积(mm2)的对数为横、纵坐标,制作 模范曲线,将样品所构成透明圈的直径乘积代入即得活气<9,14,15>。也有研究者用透明 圈的两垂直直径乘积与所加样品体积之比(mm2·ml-1)表示酶活气<16,17>;阎家 麒等<18>以模范品酶活气和透明圈面积为横、纵坐标作图;郑铃等<19>测定构造纤溶酶原 激活物活气时,用透明圈直径与模范尿激酶活气的对数作图。因为市售的纤维蛋白原中含有少量的纤溶酶原,因此通俗纤维蛋白平板可检测出纤溶酶活性和激酶活性,一样平常用加热平板来分辨这两种活性。85℃,30min灭活纤维蛋白原中的纤溶酶原后,制备加热平板;或许将制备好的平板 85℃加热30min,检测可间接溶解纤维蛋白的纤溶酶活性。在研究蚯蚓纤溶酶的溶栓机理时 ,迟玉杰等<17>用市售的纤维蛋白原制备通俗的纤维蛋白平板,用皂土吸附掉此中的纤溶酶原后,制备无纤溶酶原的纤维蛋白平板。在发现新的溶栓活性蛋白,无模范品检测活性时,通常用尿 激酶或构造纤溶酶原激活物做模范品,用纤维蛋白平板法测定相对酶活。如郝苏丽等<20>建议 用构造纤溶酶原激活物-纤维蛋白平板法测定蚓激酶的效价;李群<14>比较了尿激酶-纤维蛋白平板法和构造纤溶酶原激活物-纤维蛋白平板法测定市售蚓激酶的效价,也建议用后者测定蚓激酶效价。1·1·2改良的纤维蛋白平板法纤维蛋白平板法存在费时、本钱高和很难模范化等缺点 ,因此在实际应用中很多研究者对该法作了一定的改良。为提高灵敏度以检测革兰氏阴性菌的构造纤溶酶原激活物活性,郑铃等<19>间接将纤维蛋白原、纤溶酶原和凝血酶室温下混匀制成不含琼脂的纤维蛋白平板,其灵敏度比加入琼脂的纤维蛋白平板提高约500倍。而且在对照平板中加入纤溶酶克制剂氨基己酸(EACA),克制纤溶酶活性,观察是否有其余蛋白酶降解纤维蛋白构成透明圈。但当对照平板和无EACA的平板都有透明圈时,此办法则不能判定究竟是其余蛋白酶单独感化构成透明圈,还是与构造纤溶酶原激活物共同感化构成透明圈。陈志文等<21>也用无琼脂的纤维蛋白平板测定枯草芽孢杆菌发生的纤溶酶活性。刘士辉等<22>采纳的SDS-PA GE纤维蛋白自显影是SDS-PAGE电泳与纤维蛋白平板的结合,将有纤溶酶原激活物的样品 与无还原剂的电泳样品缓冲液,30℃温育l~2h后,停止SDS-PAGE电泳,电泳后取下凝胶在2·5%的TritonX-100中轻轻荡洗lh,然后在凝胶上铺制一层纤维蛋白琼脂 糖凝胶,37℃湿盒中放置数小时,随时观察溶带出现环境。比较溶带地位与分子量模范品地位即可知样品中活性物的分子量。文献<23>所称用来阐发血浆中纤溶酶原激活物的存在情势。文献 <24>中测定纳豆激酶活性的血清板法也是纤维蛋白平板法的改良。将血清制成微型纤维平板, 然后在每个孔内加入分歧浓度的纳豆激酶,反应开端4h以内,每30min测定一次OD655 ,纤维构成初始,在655nm处的吸光度最大;跟着酶的加入,纤维赓续溶解,从而使吸光度下降,吸光度的下降与溶栓酶的浓度成线性相干。此法操纵简便快捷,样品消耗小,本钱低,可信度 高,可同时测定多个样品,且4h内即可实现。Jones等<23>在96孔微量平板中,加入凝血酶、样品或模范品、纤溶酶原及纤维蛋白原,制备微量纤维蛋白凝块,然后在340nm或4 05nm处,用主动阐发仪测定各时限的凝块溶解率,以此来反映纤溶酶原激活物的活性。这一改 进后的办法,使测定更疾速,重复性较好,而且容易模范化。Johannes等<25>制备适 当的微量纤维蛋白凝胶后,将血浆标本加在凝胶面上部,用405nm波长记载凝胶的吸光度值, 经25℃孵育17h后,从新测定405nm吸光度值。根据吸光度的削减与血浆纤溶酶原激活物 的量的相干性,测定样品激活物的活性。彭勇等<26>从豆豉中挑选溶栓酶时,计划以血粉为主 要基质的富集造就基,以纤维蛋白为重要基质的初筛平板,然后抉择透明圈大的菌株,摇瓶发酵后 用模范的纤维蛋白平板精确测定纤溶活性停止复筛。杨艳燕等<16>挑选产纳豆激酶的纳豆杆菌时,在纤维蛋白平板中加入25%的LB造就基,作为初筛平板。颠末改良后的纤维蛋白平板既能 使菌生长,又可检测溶栓活性,在菌种挑选中节省了工作量。张守峰等<27>测定构造纤溶酶原 激活物活气时,加入纤溶酶原使灵敏度提高了30倍,最低可检测出0·01ng(约0·001 IU)的构造纤溶酶原激活物。纤维蛋白平板中,透明圈的构成重要受保温光阴、温度、平板厚度和纤维蛋白原浓度等影响。保温光阴对测定结果影响最大,张守峰等<27>确定最适保温光阴为18~24h;迟玉杰等<17>研究蚓激酶纤溶活性保温4h;杨艳燕等<16>挑选纳豆杆菌每隔1h观察一次。温度一样平常是37℃,但LiangJF<28>在测定衔接了带正电荷的小肽<(Arg)7Cys>的构造纤溶酶原激活物活性时, 温度是30℃。Johannes等<25>用微量纤维蛋白平板测定血浆样品时,温度是25℃ 。平板厚度没有同一规定,张守峰等<27>研究发现平板厚度增长,透明圈直径略有减小,透明 圈出现光阴延长,但并不影响透明圈大小梯度及模范曲线构成。纤维蛋白原浓度也无明白规定,一 般为1mg·ml-1,张守峰等<27>用0·5、1·0、2·0mg·ml-1纤维蛋白原分离制板,研究发现纤维蛋白原含量对透明圈构成速率和梯度无显著影响。但纤维蛋白含量高,形 成的透明圈界限清楚便于观察测量。纤维蛋白平板法具有简便直观,可定性、定量测定,其灵敏度 满意大多数试验请求等优点,但是因为影响因素浩繁很难模范化,通俗的纤维蛋白平板还存在消耗 试剂多、本钱高、通量低、光阴长等缺点。改良的办法一定程度上弥补了这些缺点。1·2发色底物法发色底物(chromogenicsubstrate)是一类与对硝基苯胺(pNA)相连的短肽,如S-2251(H-D-Va l-Leu-Lys-pNA)。纤溶酶水解发色底物,天生在405nm有强接收呈黄色的对硝基苯胺,纤溶酶活性与405nm的接收值成正比,因此可用发色底物间接测定纤溶酶活性,也可 间接测定纤溶酶原激活物的活性<29>。Friberger<30>最先用S-2251为底 物测定纤溶酶和纤溶酶原的活性。基本操纵是在底物溶液中加入有活性的样品,37℃水浴1mi n;测定单位光阴内410nm光接收值的变更,并用如下4个公式计算活性。活性(U/ml) =1·19×ΔA/min活性(U/ml)=0·413×A活性(nkat/ml)=19· 8×ΔA/min活性(nkat/ml)=6·88×A研究者<31>用Sue-A1a-A 1a-Pro-Phe-PNA测定纳豆激酶的活性时,定义1min水解底物天生1μl硝基苯胺的酶量为1单位酶活。胡显文等<32>先用S-2444测定具有催化活性的双链尿激酶活性 ,然后用嗜热菌蛋白激酶激活无催化活性的单链尿激酶为双链尿激酶,用S-2444测定尿激酶 总活性,从而测定单链尿激酶的比例。发色底物法十分灵敏,可检测出低于1×10-11mol 的纤溶酶<30>,因此常用于临床检验和药物代谢研究。孙春风等<29>用S-2390(D -Val-Phe-Lys-pNA)在酶标仪上测定血浆纤溶酶原的活性,并将其用于临床检验。杜珍香等<33>测定蚯蚓纤溶酶对犬纤溶酶活性影响时,经口给药后抽血,用S-2251测 定血液纤溶酶活气变更。因为分歧酶对分歧底物的酰胺水解活气分歧,如H·Sumi等<34> 获得的纳豆激酶最敏感的底物是S-2251,其次是S-2238、S-2266和S-230 2,对尿激酶底物S-2444和弹性蛋白酶底物S-2484没有感化,发色底物法存在过分专一的成就,而且价钱昂贵,一样平常都需入口,因此限制了该办法的应用。


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